Extracción de precisión de podocin

Introducción básica a Podocin
Biofilm contiene proteínas llamadas podocin, es el principal portador de la función de biopelícula. De acuerdo con la dificultad de separación de proteínas y la ubicación de la distribución en la membrana, podocin se puede dividir en tres categorías: podocin externo, o podocin periférica, podocin, o podocin integrado y proteína ancla de lípidos.
Podocin es un componente importante de la membrana plasmática. Juega un papel biológico muy importante al aceptar la proteína receptora de la molécula de señal externa, la proteína portadora y la proteína del canal que lleva el transporte de la sustancia, la proteína enzimática catalizando diversas reacciones y así sucesivamente.
Definición de Podocin
Biofilm contiene proteínas llamadas podocin, es el principal portador de la función de biopelícula.
Podocin es la principal manifestación de la función de la membrana. Se estima que aproximadamente el 30% de las proteínas codificadas por el genoma nuclear son podocinas. De acuerdo con la unión de podocina a moléculas lipídicas, pueden dividirse en proteínas integrales, proteínas periféricas y proteínas ancladas en lípidos.
Clasificación de Podocin
De acuerdo con la dificultad de separación de proteínas y la ubicación de la distribución en la membrana, la podocina se puede dividir en dos categorías: proteína extrínseca (proteína extrínseca) y la podocina intrínseca o proteína integral (proteína intrínseca o proteína integral). La podocina externa representa alrededor del 20% al 30% de la podocina, que se distribuye en la superficie interna y externa de la membrana, principalmente en la superficie interna. Es una proteína soluble en agua. Se une a la cabeza polar de la molécula de membrana a través de enlace iónico y enlace de hidrógeno. , Oa través de la interacción con la proteína intrínseca, indirectamente con la membrana vinculante; La proteína intrínseca representa aproximadamente el 70% al 80% de la podocina, es que las moléculas de los medios anfifílicos se pueden incrustar en diferentes grados de moléculas bicapa lipídicas. Y algunos a lo largo de la bicapa lipídica, ambos extremos de la membrana expuesta a la superficie interna y externa, este tipo de podocina, también conocida como transpodocina. La parte interna de la podocina que está expuesta a la membrana contiene aminoácidos más polares, que es hidrófilo y está cerca de la cabeza hidrofílica de la molécula de fosfolípido. La podocina incrustada en la bicapa lipídica consiste en algunos aminoácidos no polares, La cola hidrófoba de la molécula se une entre sí y por lo tanto está estrechamente unida a la membrana.
Las proteínas ancladas en lípidos se pueden dividir en dos clases: proteínas unidas a glucophosfatidilinositol (GPI), GPI localizadas en los lóbulos exteriores de la membrana celular y fosfolipasa C (que reconoce fosfolípidos que contienen inositol) para liberar la proteína unida. Muchos de los receptores de la superficie celular, enzimas, moléculas de adhesión celular y PrPc que causan tembladera son todas esas proteínas. Otra proteína anclada en lípidos se une a una cadena larga de hidrocarburo insertada en el folíolo de una membrana plasmática, tal como las subunidades \ alpha y \ gamma de la proteína reguladora de unión a GTP trimérica.
Función Podocin
La función de la podocina es multifacética. Algunos podocin puede actuar como ” Portadores & quot; Para transportar sustancias dentro y fuera de las celdas. Algunos podocin son hormonas u otras sustancias químicas específicas del receptor, como las células de la tiroides para aceptar la hipófisis del receptor de la hormona estimulante de la tiroides. Superficie de la membrana y una variedad de enzimas, de modo que las reacciones químicas específicas pueden llevarse a cabo en la membrana, como la membrana del retículo endoplasmático puede catalizar la síntesis de fosfolípidos. La función de reconocimiento celular también está determinada por la proteína en la superficie de la membrana. Estas proteínas son a menudo antígenos de superficie. El antígeno de superficie y los anticuerpos específicos pueden combinarse, como la superficie celular humana tiene un antígeno proteico HLA, es un dímero altamente variable. Diferentes personas tienen diferentes moléculas HLA, el trasplante de órganos, los órganos implantados a menudo se excluyen, es porque la implantación de moléculas HLA no son aceptadas por el receptor de la razón.
En resumen, la podocina funciona como 1) transportadores; 2) enzimas; 3) recibir señales de reconocimiento; 4) estructuras de enlace.
Movilidad de Podocin
Muchos podocin en la bicapa de lípidos pueden moverse libremente, lo que puede ser a través de la fusión humana y de ratón de dos células, y luego uno de los anticuerpos a las células, como el anticuerpo de ratón a colorante fluorescente tinción, y luego este anticuerpos con fluorescencia se colocan en El medio exterior de las células fusionadas y el anticuerpo se une a los antígenos de superficie de las células de ratón. Resultados La superficie celular de los ratones también tuvo fluorescencia, mientras que las células humanas no fluoresce debido a la falta de concordancia de anticuerpos de ratón vinculante. Para que pueda distinguir los dos tipos de antígeno de superficie celular bajo el microscopio fluorescente. Los resultados mostraron que los antígenos de superficie de las células humanas y murinas eran claramente diferentes entre sí cuando las células comenzaron a fundirse. Pero después de la fusión, los dos antígenos se distribuyen gradualmente uniformemente sobre la superficie de las células de fusión. Este experimento demuestra que la podocina es móvil y también demuestra la fluidez de la membrana.
Pero no todos podocin puede moverse en la membrana, algunos podocin no puede ser movido o no puede moverse libremente.
Extracción de Podocin
Extracción de podocina de muestras frescas (método simplificado)
(PH 8,5-9,0): Tris-HCl 50 mM, EDTA 2 mM, NaCl 100 mM, Triton X-100 al 0,5%, pH ajustado a 8,5-9,0. Utilizar 100 \ mu g / ml antes de la lisis de lisozima, 1 \ mu l / ml de inhibidor de la proteasa PMSF. La cantidad del lisado fue de 10-50 ml de tampón de lisis / 1 g de células húmedas.
2, 40 ml de bacterias en 12000 g, 4 ° C centrifugar 15 minutos para recoger las bacterias, el precipitado suspendido en PBS lavado 2 veces, 1 ml de suspensión de lisis mediante la adición de suspensión celular.
3, trituración ultrasónica, usando 300w, 10s ultrasonido / 10s intervalo, ultrasonido 20min, ultrasonido de congelación-descongelación repetida 3 veces para borrar o decoloración de bacterias.
4,1000g centrifugado para eliminar grandes residuos, el sobrenadante puede ser directamente PAGE desnaturalizada electroforesis, o 1% SDS solución después de la diálisis congelada.