Descripción
Inmunoensayo ligado a enzimas de fipronil (ELISA)
Manual de instrucciones del kit
Este kit es para uso exclusivo en investigación.
1 Finalidad de uso:
Este kit se utiliza para la detección cuantitativa de residuos de fipronil en piensos, pescado, camarones y tejidos cárnicos (como pollo, res y cerdo), huevos, miel, leche, suero y orina.
2 Principio experimental
Este kit adopta el método ELISA competitivo. La placa de micropocillos se recubre con antígeno acoplado de fipronil, se agrega el estándar de fipronil o se agrega una muestra, el fipronil libre se recubre previamente con el antígeno acoplado de fipronil en la tira de micropocillos Competir con marcadores de enzimas de anticuerpos anti-fipronil, desarrollar el color con el sustrato de TMB, cambiar el color de azul a amarillo después de agregar la solución de parada, utilice un lector de microplacas para detectar a una longitud de onda de 450 nm, la absorbancia y el contenido de fipronil en la muestra. Inversamente proporcional, el contenido de fipronil en la muestra se calculó a partir de la curva estándar.
3 Composición del kit
3.1 Placa de ELISA desprendible de antígeno acoplado con fipronil prerrevestida: 1 pieza (12 pocillos × 8 tiras).
3.2 Estándar de fipronil: 6 botellas (1ml / botella), el contenido es: 0 ppb, 0.1 ppb, 0.3 ppb, 0.9 ppb, 2.7 ppb, 8.1 ppb.
3.3 Conjugado de enzima anticuerpo anti-fipronil: 1 frasco (6ml).
3.4 Solución de revelado de color A: 1 botella (6 ml).
3.5 Fluido revelador de color B: 1 botella (6ml).
3.6 Solución de parada: 1 botella (6 ml), ácido sulfúrico 2M.
3.7 Diluyente de la muestra: 1 botella (10 ×, 6 ml), utilizada para la dilución de la muestra.
3.8 Líquido de lavado concentrado: 1 botella (20 ×, 20 ml), utilizada para el lavado de platos.
3.9 Una hoja de instrucciones.
4 Materiales necesarios pero no proporcionados
4.1 Equipo
4.1.1 Lector de microplacas con una longitud de onda de 450nm.
4.1.2 Trituradora.
4.1.3 Probeta graduada.
4.1.4 Oscilador.
4.1.5 Embudo.
4.1.6 Papel de filtro Whatman No 1 o equivalente. 4.1.7 Micropipeta.
4.2 Reactivos
4.2.1 Agua desionizada o agua destilada.
4.2.2 Metanol.
5 almacenamiento
5.1 El kit se almacena a 2 ~ 8 ℃, no congelar
5.2 Las microplacas no utilizadas deben sellarse y almacenarse secas
6 asuntos que necesitan atención
6.1 Lea atentamente las instrucciones antes de utilizar el kit.
6.2 No utilice kits caducados.
6.3 Antes de usar el kit, vuelva a poner los reactivos a temperatura ambiente (25 ± 2 ° C). Se recomienda volver a la temperatura durante al menos 2 horas.
6.4 El producto estándar contiene fipronil, por lo que se debe tener especial cuidado al usarlo y se deben usar guantes durante la operación.
6.5 La solución de parada contiene ácido sulfúrico, que evita quemaduras en la piel y corrosión de la ropa durante su uso.
6.6 No se pueden mezclar puntas para diferentes estándares y muestras; de lo contrario, los resultados de la prueba se verán afectados.
6.7 Los reactivos de los kits de diferentes números de lote no deben mezclarse; las puntas utilizadas para diferentes estándares y muestras no deben mezclarse, de lo contrario afectará a los resultados experimentales.
6.8 El diluyente de muestra en este kit debe usarse al diluir la muestra, de lo contrario afectará los resultados experimentales
6.9 Debe evitarse la formación de espuma al mezclar reactivos.
7 Preparación del fluido de trabajo
Solución estándar de fipronil 7.1: 0ppb, 0.1ppb, 0.3 ppb, 0.9ppb, 2.7 ppb, 8.1ppb
7.2 Líquido de lavado concentrado: Diluir 1:20 (1 + 19) con agua destilada para su uso
7.3 Diluyente de muestra: Diluir 1:10 (1 + 9) con agua destilada para su uso
7.3 Agente cromogénico: reservado, evitar la luz directa
7.4 Solución de parada de reacción: lista para usar
8 Procedimientos de procesamiento de muestras (las muestras deben operarse estrictamente de acuerdo con las instrucciones durante el proceso de extracción, y el proceso de extracción debe diluirse con precisión; de lo contrario, los resultados serán inexactos, las muestras deben almacenarse en un lugar fresco y oscuro y refrigerarse)
8.1 Tomar 10 g de muestra triturada y agregar 20 ml de solución de metanol al 70%
8.2 Vibrar vigorosamente durante 3 minutos
8.3 Filtrar con papel de filtro Whatman No 1
8.4 Tome 25 µl de la muestra procesada y agregue 25 µl de diluyente de muestra al pocillo de reacción (el factor de dilución de la muestra es 2)
9 Pasos del inmunoensayo enzimático
9.1 Instrucciones experimentales
9.1.1 Restaure completamente todos los reactivos fuera de la caja a temperatura ambiente (25 ± 2 ° C) antes de que comience el experimento durante aproximadamente 2 horas. Después de calentar a temperatura ambiente (25 ± 2 ℃), saque las tiras microporosas, vuelva a sellar las tiras microporosas sobrantes y guárdelas inmediatamente a 2 ~ 8
Nota: asegúrese de que el retorno de temperatura sea suficiente, de lo contrario, la precisión y exactitud de la detección se verán afectadas.
9.1.2 Vuelva a colocar el reactivo a 2 ~ 8 ℃ para almacenarlo inmediatamente después de su uso.
9.1.3 No modifique el programa de análisis
9.1.4 Utilice una micropipeta precisa
9.1.5 Una vez que comience la operación, no interrumpa ningún programa
9.1.6 La reproducibilidad de los resultados de ELISA depende en gran medida de los procedimientos operativos, opere estrictamente de acuerdo con los requisitos
9.1.7 Con el fin de evitar la contaminación cruzada, cada patrón y cada muestra deben llenarse con puntas diferentes.
9.1.8 No permita que la punta de la pipeta toque la solución o la superficie interna del micropocillo al agregar muestras.
9.2 Pasos de análisis
9.2.1 Numeración previa, marcando la pos.
ión de B0, estándares y muestras, se recomienda realizar la detección de doble orificio
9.2.2 Tome la cantidad requerida de microporos (las tiras de microporos se pueden quitar), vuelva a sellar las tiras sobrantes y vuelva a colocarlas inmediatamente a 2 ~ 8 ℃ para almacenar
9.2.3 La solución de dilución de la muestra (10 ×), la solución de lavado concentrada (20 ×) se diluyen en la solución de trabajo (diluida con agua destilada o agua desionizada)
9.2.4 Añada 50 µl de solución estándar de 0,0ppb al pocillo B0
9.2.5 Añada 50 μl de solución estándar a cada pocillo estándar
9.2.6 Añada 50 µl de solución de muestra a cada pocillo de muestra.
9.2.7 Añada 50 µl de conjugado enzimático de anticuerpo anti-fipronil a todos los pocillos
9.2.8 Agite suavemente la placa de reacción durante unos segundos.
9.337 ℃ de baño tibio durante 30 minutos (golpear la placa de reacción de vez en cuando durante el baño tibio puede reducir el error de doble orificio)
9.3.1 Sacuda el líquido de los pocillos, lave la microplaca 5 veces con loción y golpee el papel absorbente por última vez para eliminar completamente el líquido de los pocillos.
9.4 Reacción
9.4.1 Una vez completado el procedimiento de lavado, utilice inmediatamente una micropipeta para agregar 50 µl de solución cromogénica A y luego 50 µl de solución cromogénica B a cada micropocillo; agite ligeramente la placa de reacción para mezclarla bien
9.4.237 ℃ baño caliente durante 10min
9.4.3 Añada 50 µl de solución de parada a cada pocillo y mezcle bien
9.4.4 Detecte la absorbancia a 450 nm y lea el resultado en 5 minutos.
10 Cálculo de resultados
10.1 Análisis cuantitativo
10.1.1 El valor medio (B) del valor de absorbancia de cada solución estándar de concentración y muestra obtenida se divide por el valor de absorbancia (B0) del primer estándar (estándar 0) y se multiplica por 100%, que es el valor porcentual de absorbancia. .
B: valor de absorbancia promedio de la solución estándar o solución de muestra B0: valor de absorbancia promedio de la solución estándar de 0 ppb
10.1.2 Utilice el valor logarítmico de la concentración de fipronil como eje X y el valor de absorbancia porcentual como eje Y para dibujar una curva estándar. De acuerdo con el valor porcentual de absorbancia de la muestra, la abscisa del punto correspondiente se puede obtener de la curva, que es el logaritmo de la concentración de fipronil, y el antilog es la concentración de fipronil C (ppb) en la solución de medición.
10.1.3 Dado que la muestra ha sido prediluida, la concentración de la muestra obtenida de la curva estándar debe multiplicarse por su factor de dilución.
10.2 Determinación semicuantitativa
10.1.1 Determinación visual semicuantitativa: Primero, seleccione una solución estándar apropiada y ejecútela con la muestra, y juzgue si el valor de concentración de la muestra es menor o mayor que el valor estándar basado en la comparación de colores entre la muestra y el estándar. .
10.1.2 Medición semicuantitativa del instrumento: Primero seleccione una solución estándar apropiada y ejecútela con la muestra, y juzgue si el valor de concentración de la muestra es menor o mayor que el valor estándar basado en la comparación de los valores de absorbancia. de la muestra y el estándar.
11 especificidad
Sustancia Reacción cruzada fipronil 100%
12 parámetros del kit
El límite inferior de detección de este kit es de 0,05 ppb. El mejor valor de absorbancia de B0 debe ser superior a 1,0
El error dentro de la placa de absorbancia del kit es inferior al 8% y el error entre las placas es inferior al 15%. La tasa de recuperación del método de extracción de muestras de tejido que se proporciona en este manual es superior al 80%. 13
El rango de curva estándar proporcionado por el kit es de 0.1ppb ~ 8.1ppb.
14 Limitaciones de análisis
Las muestras que resulten positivas con este kit deben confirmarse mediante otro método, como HPLC o GC / MS.
