Descripción
Tipo de producto: No conjugado
Ciclo de entrega: spot
Cantidad: 3000 veces
Introducción del producto
Este kit de detección de viabilidad celular CCK-8 contiene WST-8 (2- (2-metoxi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfobenceno) -2H-tetrazol sal monosódica) . En presencia de portadores de electrones, el WST-8 se oxida y se reduce mediante la deshidrogenasa intracelular para producir colorantes formazan amarillo anaranjado solubles en agua que se pueden disolver en medio de cultivo de tejidos. La cantidad de formazán es directamente proporcional al número de células vivas. El método CCK-8 es un método de detección colorimétrico no radiactivo y altamente sensible que se utiliza para determinar el número de células vivas en experimentos de proliferación celular o toxicidad, que pueden reemplazar al método tradicional MTT.
Traiga sus propios instrumentos y reactivos fuera del kit.
Centrífuga de baja velocidad, lector de microplacas (longitud de onda de 450 nm), agitador de placas, micropipeta, placa de cultivo de 96 pocillos, incubadora de CO2
Pasos
- Por lo general, agregue 100 ul (2000 células) por orificio para experimentos de proliferación celular, agregue 100 ul (10000 células) por orificio para experimentos de citotoxicidad (el número específico de células utilizadas en cada orificio depende del tamaño de las células, la velocidad de proliferación celular , etc.) Los factores determinan). Incubar previamente la placa de cultivo en una incubadora durante 24 horas (a 37 ° C, 5% de CO2).
- De acuerdo con las necesidades del experimento, cultive y administre 0-10ul de estimulación con fármacos específicos.
- Mantenga la placa de cultivo en la incubadora durante un período de tiempo adecuado (por ejemplo: 24 horas o 48 horas).
- Agregue 10 ul de solución CCK-8 a cada pocillo. Si el volumen de cultivo inicial es 200 ul, es necesario añadir 20 ul de solución CCK-8 y el resto puede deducirse por analogía. Los pocillos con las cantidades correspondientes de medio de cultivo celular y solución de CCK-8, pero sin células, pueden usarse como control en blanco. Si le preocupa que los medicamentos utilizados interfieran con la prueba, debe configurar los pocillos con la cantidad correspondiente de medio de cultivo celular, medicamentos y solución CCK-8, pero no células agregadas como control en blanco. (Trate de no generar burbujas en el agujero)
- Incube la placa de cultivo en la incubadora durante 1-4 horas.
- Mida la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas.
- Si no desea medir el valor de DO temporalmente y planea medirlo más tarde, puede agregar 10 μl de solución de HCl 0.1 M o solución SDS al 1% (P / V) a cada pocillo y cubrir la placa de cultivo para evitar Encienda y almacene a temperatura ambiente. La absorbancia no cambiará en 24 horas.
Juicio de resultado
(1) Tasa de supervivencia celular: reste el valor de DO de fondo del valor de DO de cada pocillo de prueba (medio completo más CCK-8, sin células) y tome la media ± DE para el valor de DO de cada pocillo repetido.
La tasa de supervivencia celular se expresa como T / C%, T es el valor de DO de las células con el fármaco añadido y C es el valor de DO de las células de control. Tasa de supervivencia celular% = (DO de células con fármaco agregado / DO de células de control) × 100
(2) Encuentre la concentración de fármaco a T / C = 50% (IC50) o la concentración de fármaco a T / C = 10% (IC90).
Condiciones de almacenamiento: 4 ℃ protegido de la luz, válido por un año
Precauciones
- Preste atención a la suspensión celular que debe mezclarse durante la inoculación para evitar la precipitación de células, lo que resulta en un número desigual de células en cada pocillo, puede mezclarlo cada vez que inocule varios pozos. El medio de cultivo en un círculo de orificios alrededor de la placa de cultivo es fácil de volatilizar. Para reducir los errores, se recomienda que solo se agregue PBS medio o estéril a cada orificio en los cuatro lados de la placa de cultivo, no como un orificio de detección de índice.
- El mejor tiempo de respuesta de CCK-8 está sujeto al mejor tiempo para el desarrollo de un color específico. Al hacer el experimento por primera vez, se recomienda hacer algunos pozos para averiguar el número óptimo de células inoculadas y el tiempo óptimo de incubación después de agregar el reactivo CCK-8. En circunstancias normales, los glóbulos blancos son más difíciles de desarrollar el color, por lo que se requiere un tiempo de reacción de CCK-8 más prolongado o aumentar el número de células (~ 105 células / pocillo). Las células en suspensión son difíciles de desarrollar color en comparación con las células adherentes. Para las células en suspensión, después de agregar CCK-8 e incubar durante 1-4 horas, se pueden sacar primero de la incubadora y el grado de tinción se puede observar visualmente o determinar con un lector de microplacas para determinar el mejor tiempo de incubación para CCK. -8. Si es difícil desarrollar el color, vuelva a colocar la placa de cultivo en la incubadora y continúe incubando durante unas horas antes de medir. Para las células adherentes, el tiempo de incubación de CCK-8 es generalmente de 1 a 4 horas. La mayoría de las células se pueden observar visualmente después de 30 minutos de incubación, y el efecto de detección es mejor cuando se incuban durante aproximadamente 2-4 horas.
- La detección de este kit depende de la reacción catalizada por la deshidrogenasa. Si hay más agentes reductores en el sistema para detectar, por ejemplo, algunos antioxidantes interferirán con la detección, intente eliminarlos. El medio que contiene rojo de fenol no afecta la determinación de la viabilidad celular en este kit.
- ¿Cómo determinar si la solución a ensayar es reducible? Añada 10 μl de solución CCK-8 a los pocillos de la solución de prueba sin células, incube durante 1-4 horas y mida la absorbancia del blanco a 450 nm. Si la absorbancia es pequeña, significa que hay menos agente reductor en el sistema que se va a probar y se puede agregar CCK-8 directamente en la prueba formal; si la absorbancia es relativamente grande, significa que hay más agentes reductores en el sistema que se va a probar y que el sistema que se va a probar se prueba formalmente. En este caso, es necesario eliminar el medio, lavar las células dos veces con el medio y luego agregar un nuevo medio y 10 μl de CCK-8 para la detección.
- Si la muestra es una suspensión celular con alta turbidez, se recomienda establecer 600 nm (o más de 600 nm) como longitud de onda de referencia y restar el valor de D.E. de la longitud de onda de referencia.
- Utilice una bata de laboratorio y guantes desechables para la operación.
